Produktion rekombinanter MSP119-Varianten von Plasmodium falciparum in Nicotiana tabacum zur Evaluierung als Malaria-Impfstoffkandidaten

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Diplomarbeit aus dem Jahr 2010 im Fachbereich Biologie - Mikrobiologie, Molekularbiologie, Note: 1,0, Rheinisch-Westfälische Tech...

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Beschreibung

Diplomarbeit aus dem Jahr 2010 im Fachbereich Biologie - Mikrobiologie, Molekularbiologie, Note: 1,0, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen (Institut für Molekulare Biotechnolgie), Sprache: Deutsch, Abstract: In Rahmen dieser Diplomarbeit konnte gezeigt werden, dass MSP119, das als potentieller Impfstoffkandidat für ein Malaria-Vakzin betrachtet wird, erfolgreich in Nicotiana tabacum und Nicotiana benthamiana exprimiert werden kann. Es wurden Expressionsvektoren generiert, die die transiente Expression der vier homologen MSP119-Varianten 3D7, FUP, WELLCOME und TYPE2 sowohl einzeln, als auch als N-, sowie C-terminale Fusionen an DsRed, mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Systems, in Pflanzen ermöglichten. Die Gene der vier Isolate waren bei ihrem in silico Design unterschiedlich an die Codon-Präferenz von Tabak angepasst worden. Die Resultate der immunologischen Experimente, die mit Hilfe des MSP119-spezifischen mAB 5.2 durchgeführt wurden, zeigten auf, dass sich alle Varianten gut in Pflanzen exprimieren ließen. Die im Fall von TYPE2 gewählte Codon-Usage führte in allen Varianten zu der höchsten Akkumulation. Die C-terminalen Fusionen zeigten generell im direkten Vergleich mit ihren N-terminalen Gegenstücken eine um den Faktor zwei höhere Akkumulation in Tabakzellen. Dies gilt es aber in zukünftigen Versuchen zu verifizieren. Das gereinigte MSP119_3D7-DsRed zeigte im Verhältnis zu den anderen Fusionsproteinen die wenigsten Degradationsbanden auf. Es fand eine weiterführende Evaluation mit Hilfe des Biacore T100-System statt, indem Interaktionen der MSP119-Varianten mit den MSP119-spezifischen und Konformations-abhängigen mAbs 12.8, 12.10, 5.2, 2F10 und 1E1 nachgewiesen werden konnte. Dies deutet darauf hin, dass der MSP119-Teil des Fusionsproteins in seiner nativen Struktur vorliegt. In anschließenden Immunisierungsversuchen mit BALB/c-Mäusen, konnten humorale immunantworten gegen MSP119_3D7-DsRed nachgewiesen werden. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass im transienten Ansatz genügend pflanzliches MSP119 zur Evaluierung produziert wurde, das darüber hinaus sehr wahrscheinlich korrekt gefaltet. Darüber hinaus erwies sich MSP119_3D7-DsRed als immunogen. Hierdurch wurden entscheidende Vorraussetzungen für die weitere Entwicklung eines MSP119-basierten Vakzinkandidaten geschaffen. Neben der Produktion verschiedener MSP119-Proteine, konnten während dieser Diplomarbeit auch chimäre Varianten der inhibitorischen monoklonalen Antikörper 12.8 und 12.10, die spezifisch gegen MSP119 sind, hergestellt werden. Dazu wurden die murinen variablen Domänen der schweren sowie der leichten Kette der mAbs 12.8 und 12.10 an die konstante Region......