Untersuchungen zur Denaturierung und Rückfaltung von Lysozym und ß-Lactoglobulin

Inhaltsangabe:Einleitung: Die gezielte Überproduktion von rekombinanten Proteinen in Escherichia coli ist eine etablierte Methode zur selektiven Synthese von Proteinen. Die Proteine werden somit in großer Menge produziert, deren Isolierung aus dem entsprechenden Gewebe ansonsten erheblich aufwändiger wäre. In vielen Fällen weisen jedoch exprimierte Proteine eine fehlerhafte Faltung auf. Es kann zur Ausbildung von falschen Disulfidbrücken kommen oder die Proteine können in ihren Sekundär- und Tertiärstrukturen fehlerhaft gefaltet sein. Als Konsequenz bilden sich unlösliche hochmolekulare Aggregate, die sogenannten Inclusion Bodies, die im Zytoplasma akkumulieren und aus biologisch inaktiven Proteinen bestehen. Um die Inclusion Body-Proteine in eine lösliche Form zu bringen ist eine Solubilisierung notwendig. Anschließend müssen die Proteine durch geeignete Verfahren zurückgefaltet werden, um ihre native Konformation und somit die biologische Aktivität zu erlangen. Die Rückfaltung von Proteinen ist ein komplizierter Prozess, der von vielen Parametern wie Temperatur, pH-Wert und den Eigenschaften des Lösungsmittels abhängt (Kayser, 2002). Oft müssen zahlreiche Vorversuche durchgeführt werden, um die richtigen Bedingungen für die Rückfaltung herauszufinden (Tsumoto et al., 2003). Die spezifischen Merkmale des jeweiligen Proteins beeinflussen ebenfalls den Renaturierungsprozess; deshalb erfordert die Rückfaltung des entfalteten Proteins häufig für jedes Protein ein spezielles Rückfaltungsprotokoll. Die Ausbeute des nativen Proteins wird oft durch Aggregationsprozesse, die als Nebenreaktionen in kinetischer Konkurrenz mit der Rückfaltungsreaktion stehen, herabgesetzt (Singh and Panda, 2005; Middelberg, 2002). Mittlerweile existiert eine Vielzahl von verschiedenen Strategien und Methoden, die zur Rückfaltung von Proteinen eingesetzt werden können. Dennoch gibt es keine universelle Rückfaltungstechnik, die alle Anforderungen der Proteinrückfaltung erfüllt (Middelberg, 2002). Nur wenn die renaturierten Proteine die Eigenschaften des nativen Proteins besitzen, ist der Erfolg der Renaturierung sichergestellt. In den letzten Jahren wurden mit Hilfe von schnellen Computern große Fortschritte bei der Modellierung der Faltungsvorgänge erreicht. Allerdings ist eine verlässliche Vorhersage der dreidimensionalen Struktur eines Proteins aus seiner Primärstruktur noch nicht möglich (Horton et al., 2008). Die Aufklärung der Mechanismen der Proteinfaltung ist immer [...]

Zusammenfassung
Inhaltsangabe:Einleitung:Die gezielte Überproduktion von rekombinanten Proteinen in Escherichia coli ist eine etablierte Methode zur selektiven Synthese von Proteinen. Die Proteine werden somit in großer Menge produziert, deren Isolierung aus dem entsprechenden Gewebe ansonsten erheblich aufwändiger wäre. In vielen Fällen weisen jedoch exprimierte Proteine eine fehlerhafte Faltung auf. Es kann zur Ausbildung von falschen Disulfidbrücken kommen oder die Proteine können in ihren Sekundär- und Tertiärstrukturen fehlerhaft gefaltet sein. Als Konsequenz bilden sich unlösliche hochmolekulare Aggregate, die sogenannten Inclusion Bodies, die im Zytoplasma akkumulieren und aus biologisch inaktiven Proteinen bestehen. Um die Inclusion Body-Proteine in eine lösliche Form zu bringen ist eine Solubilisierung notwendig. Anschließend müssen die Proteine durch geeignete Verfahren zurückgefaltet werden, um ihre native Konformation und somit die biologische Aktivität zu erlangen. Die Rückfaltung von Proteinen ist ein komplizierter Prozess, der von vielen Parametern wie Temperatur, pH-Wert und den Eigenschaften des Lösungsmittels abhängt (Kayser, 2002). Oft müssen zahlreiche Vorversuche durchgeführt werden, um die richtigen Bedingungen für die Rückfaltung herauszufinden (Tsumoto et al., 2003). Die spezifischen Merkmale des jeweiligen Proteins beeinflussen ebenfalls den Renaturierungsprozess; deshalb erfordert die Rückfaltung des entfalteten Proteins häufig für jedes Protein ein spezielles Rückfaltungsprotokoll. Die Ausbeute des nativen Proteins wird oft durch Aggregationsprozesse, die als Nebenreaktionen in kinetischer Konkurrenz mit der Rückfaltungsreaktion stehen, herabgesetzt (Singh and Panda, 2005; Middelberg, 2002). Mittlerweile existiert eine Vielzahl von verschiedenen Strategien und Methoden, die zur Rückfaltung von Proteinen eingesetzt werden können. Dennoch gibt es keine universelle Rückfaltungstechnik, die alle Anforderungen der Proteinrückfaltung erfüllt (Middelberg, 2002). Nur wenn die renaturierten Proteine die Eigenschaften des nativen Proteins besitzen, ist der Erfolg der Renaturierung sichergestellt.In den letzten Jahren wurden mit Hilfe von schnellen Computern große Fortschritte bei der Modellierung der Faltungsvorgänge erreicht. Allerdings ist eine verlässliche Vorhersage der dreidimensionalen Struktur eines Proteins aus seiner Primärstruktur noch nicht möglich (Horton et al., 2008). Die Aufklärung der Mechanismen der Proteinfaltung ist immer []