Zwei Jahre sind vergangen, seit der sanftmütige Peter Parker (Tobey Maguire) seine große Liebe Mary Jane Watson (Kirsten Dunst) zurücklassen musste, um sich als Spider-Man seinem Credo "Mit großer Macht kommt auch große Verantwortung" zu stellen. Eine Aufgabe, die für Peter zugleich Fluch und Segen bedeutet, denn zwischen seinen beiden Identitäten als die Person Peter Parker und dem Superhelden Spider-Man ist er fortan gezwungen, ein einsames Doppelleben voller Konflikte zu führen.

Auch Mary Jane hat ihr Leben inzwischen weiter geführt - ohne Peter. Sie hat eine Karriere als Schauspielerin begonnen und einen neuen Mann an ihrer Seite. Sehr zum Missfallen von Peter, der sich immer noch voller Sehnsucht nach ihr verzehrt und gegen den ständigen Impuls ankämpfen muss, sein geheimes Leben aufzugeben und MJ endlich seine Liebe zu gestehen. Doch damit nicht genug: Auch Peters Verhältnis zu seinem besten Freund Harry Osborn (James Franco) wird überschattet durch dessen abgrundtiefen Hass auf Spider-Man, den er für den Tod seines Vaters verantwortlich macht.

Peters Leben wird noch komplizierter, als er in Dr. Otto Octavius (Alfred Molina) seinen neuen Erzrivalen "Doc Ock" trifft. Um ihn bekämpfen zu können, muss Peter lernen, sein Schicksal zu akzeptieren und auf seine übermenschlichen Kräfte zurückgreifen.