Prozessentwicklung zur Produktion rekombinanter Proteinaggregate in Yarrowia-Hefen

Von:

Oliver Birrenbach

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Proteinaggregate werden häufig als unerwünschte Nebenprodukte der rekombinanten Proteinbiosynthese betrachtet, können jedoch aufgrund ihrer einfachen Isolierbarkeit aus Zelllysaten und potenziell erhaltener enzymatischer Aktivität biotechnologisch von Interesse sein. Ziel der Arbeit war die Etablierung eines systematischen Prozesses zur gezielten Produktion aktiver Proteinaggregate in Yarrowia lipolytica. Hierfür wurde eine modulare Vektorbibliothek mit 29 Kombinationen aus pull-down-tags und Zielproteinen konstruiert und genomisch in Y. lipolytica PO1f integriert. Für die Kultivierung wurde ein neuartiges, chemisch definiertes ISY-Medium entwickelt, das im Vergleich zu etablierten Medien eine Verdopplung der Wachstumsraten ermöglichte. Die mittels TDoT-tag gezielt unlöslich exprimierte Uricase konnte aus der unlöslichen Zellfraktion isoliert werden und wies bei einer Konzentration von 0,331 mg·L¹ eine hohe spezifische Aktivität von 39,3 U·mg¹ auf. Zur Erhöhung der Produktivität wurde ein fed-batch-Bioreaktorprozess mit wachstumsadaptiver Steuerung auf Basis eines Generic Model Control-Algorithmus unter Einsatz von Softsensoren implementiert. Die Kultivierung erfolgte entlang vorgegebener Wachstumsraten. Bei der Aufreinigung von Proteinaggregaten aus Zelllysaten führte eine Vorklärung bei pH 8 unter Zusatz von 0,0051 % Chitosan zu einer Reduktion zellulärer Partikel um >95 %. Im anschließenden Ultrafiltrationsprozess mit einer 50 nm keramischen Rohrmembran wurde limitierendes Membranfouling beobachtet. Eine Modellierung zeigte eine intermediäre Porenverstopfung, die konzentrations- und druckabhängig war. Es wurde eine vielseitige Plattform zur molekularbiologischen Konstruktion, Prozessführung und Aufreinigung aktiver Proteinaggregate in Y. lipolytica etabliert.