Hemmung der Expression von porzinen endogenen Retroviren (PERVs) mittels RNA-Interferenz

Die Xenotransplantation vom Schwein auf den Menschen ist mit dem Risiko der Übertragung von porzinen endogenen Retroviren (PERVs) verbunden, die im Genom jeder Zelle des Schweins integriert sind und sich nicht durch DPF-(designated pathogen free) Zucht eliminieren lassen. PERVs infizieren humane Zellen in vitro, womit die Möglichkeit einer in vivo Infektion des humanen immunsuppremierten Rezipienten nicht ausgeschlossen werden kann. In den letzten Jahren wurde deshalb nach Möglichkeiten gesucht, die Übertragung zu verhindern. Die RNA-Interferenz stellt hierbei eine vielversprechende Strategie dar, da sie die Replikation von PERV posttranskriptional unterbinden kann. So gelang es, transgene Schweine zu generieren, die in der Lage waren, shRNAs stabil zu exprimieren. In isolierten primären Fibroblasten der transgenen Schweine wurde das fluoreszierende GFP mittels Fluoreszenzmikroskopie sowie die Integration des Transgens mittels PCR nachgewiesen, indem zum einen das gfp-Gen und der verwendete lentivirale Vektor, als auch die Expressionskassette der shRNA detektiert wurden. Alle entnommenen primären Fibroblasten enthielten Proviren der Subtypen A, B und C, die mittels PCR nachgewiesen wurden. Zudem konnte die Expression der Volllängen-mRNA sowie gespleißter env-mRNA mittels RT-PCR gezeigt werden. Um die Sensitivität der Nachweismethoden der PERV-Expression zu erhöhen, wurde eine neue one-step RT real-time PCR unter Verwendung neuer Primer und Sonde etabliert. Dadurch konnte eine verbesserte Detektion der shRNA-induzierten Hemmung der PERV-Expression um bis zu 93 % anstelle früherer 70 % nachgewiesen werden. Um die Effektivität der RNA-Interferenz weiter zu erhöhen, wurden neue PERV-mRNA-spezifische shRNAs generiert und mit der bisher verwendeten shRNA zu Tandems kombiniert. Nach der Klonierung der Expressionskassetten in einen retroviralen Vektor und der Transfektion in eine Verpackungszelllinie, konnten keine retroviralen Partikel nachgewiesen werden. Die Zielzellen PK15- und PERV-A/C-infizierten 293 wurden daraufhin direkt transfiziert. Die quantitative Bestimmung der PERV-Expression erfolgte molekularbiologisch mittels one-step RT real-time PCR und proteinchemisch mittels Western Blot...

Zusammenfassung
Diplomarbeit aus dem Jahr 2009 im Fachbereich Biologie - Mikrobiologie, Molekularbiologie, Note: 1,3, Universität Potsdam (Robert Koch-Institut), Sprache: Deutsch, Abstract: Die Xenotransplantation vom Schwein auf den Menschen ist mit dem Risiko der Übertragung von porzinen endogenen Retroviren (PERVs) verbunden, die im Genom jeder Zelle des Schweins integriert sind und sich nicht durch DPF-(designated pathogen free) Zucht eliminieren lassen. PERVs infizieren humane Zellen in vitro, womit die Möglichkeit einer in vivo Infektion des humanen immunsuppremierten Rezipienten nicht ausgeschlossen werden kann. In den letzten Jahren wurde deshalb nach Möglichkeiten gesucht, die Übertragung zu verhindern. Die RNA-Interferenz stellt hierbei eine vielversprechende Strategie dar, da sie die Replikation von PERV posttranskriptional unterbinden kann. So gelang es, transgene Schweine zu generieren, die in der Lage waren, shRNAs stabil zu exprimieren. In isolierten primären Fibroblasten der transgenen Schweine wurde das fluoreszierende GFP mittels Fluoreszenzmikroskopie sowie die Integration des Transgens mittels PCR nachgewiesen, indem zum einen das gfp-Gen und der verwendete lentivirale Vektor, als auch die Expressionskassette der shRNA detektiert wurden. Alle entnommenen primären Fibroblasten enthielten Proviren der Subtypen A, B und C, die mittels PCR nachgewiesen wurden. Zudem konnte die Expression der Volllängen-mRNA sowie gespleißter env-mRNA mittels RT-PCR gezeigt werden. Um die Sensitivität der Nachweismethoden der PERV-Expression zu erhöhen, wurde eine neue one-step RT real-time PCR unter Verwendung neuer Primer und Sonde etabliert. Dadurch konnte eine verbesserte Detektion der shRNA-induzierten Hemmung der PERV-Expression um bis zu 93 % anstelle früherer 70 % nachgewiesen werden.Um die Effektivität der RNA-Interferenz weiter zu erhöhen, wurden neue PERV-mRNA-spezifische shRNAs generiert und mit der bisher verwendeten shRNA zu Tandems kombiniert. Nach der Klonierung der Expressionskassetten in einen retroviralen Vektor und der Transfektion in eine Verpackungszelllinie, konnten keine retroviralen Partikel nachgewiesen werden. Die Zielzellen PK15- und PERV-A/C-infizierten 293 wurden daraufhin direkt transfiziert. Die quantitative Bestimmung der PERV-Expression erfolgte molekularbiologisch mittels one-step RT real-time PCR und proteinchemisch mittels Western Blot...