Bedeutung von Blutbestandteilen für die Funktion des Zentralnervensystems des Blutegels

Das Zentralnervensystem des medizinischen Blutegels ist ein gut untersuchtes neurophysiologisches Modellsystem. Es ist in einem großen Blutgefäß des Egels lokalisiert und ständig von Blut umspült. Blutegelblut enthält verschiedene organische Säurereste, welche alle Intermediärprodukte des Citratzyklus sind. Der prominenteste organische Säurerest ist Malat.
Die vorliegende Arbeit untersucht die Bedeutung dieser Blutbestandteile für die Funktion des Zentralnervensystems des Blutegels. Des Weiteren wird eine Malat-haltige Ringerlösung entwickelt und getestet, die geeignet ist, die Lebensdauer isolierter Teile des Blutegel-ZNS von einem Tag auf eine Woche zu verlängern, ohne auf Zellkulturmedien zurückzugreifen.
Untersucht wird die Wirkung von Glucose, Pyruvat und Malat auf Funktion und Lebensdauer von Segmentalganglien des Zentralnervensystems des Blutegels. Hierzu wurden isolierte Segmentalganglien von Hirudo verbana in Lösungen mit 10 mM Glucose, 5 mM Pyruvat, 15 mM Malat bzw. einer Lösung, die frei von diesen Substanzen war, aufbewahrt. Zu definierten Zeiten erfolgte eine Bestimmung der elektrophysiologischen Parameter zweier verschiedener Neuronen sowie von Gliazellen mittels intrazellulärer Ableitung und Applikation von Neurotransmittern. Darüber hinaus wurde die mechanische Konsistenz und die lichtmikroskopisch erfassbare Morphologie der Segmentalganglien dokumentiert.

Autorentext

Michael Nießing wurde 1987 in Oberhausen geboren. Sein Studium der Biologie an der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf schloss er im Jahre 2011 mit dem akademischen Grad Diplom-Biologe erfolgreich ab. Seitdem war er unter anderem als Pharmaberater und Nachhilfelehrer tätig.

Leseprobe
Textprobe:
Kapitel 1.4, Wirkung von Aufbewahrungsmedien auf isolierte Segmentalganglien:
In an den Blutegel angepasster Ringerlösung ( Normalsalzlösung ) beträgt die Lebensdauer isolierter Segmentalganglien etwa einen Tag (Lucht 1997, Falkenberg 2009). Isolierte Neuronen überleben in Ringerlösung 2 Tage (Nicholls 1987).
Die Inkulturnahme isolierten Blutegel-Segmentalganglien oder Neuronen ist eine etablierte Arbeitstechnik. Als Kulturmedium wurde Leibovitz-Medium L-15 zum ersten Mal bei Miyazaki et al. (1975) für diesen Zweck verwendet. L-15-Medium ist ein Gewebekulturmedium, das zur Kultivierung von neuronalem Gewebe, aber auch von Invertebraten-Zelllinien geeignet ist (Morton 1970). Es enthält anorganische Salze (Na+, Cl-, K+, Mg2+, H2PO4-), 17 proteinogene Aminosäuren (kein Aspartat, Glutamat, oder Prolin), Vitamine aus der B-Gruppe, Galaktose, 5 mM Pyruvat und weitere Bestandteile in Konzentrationen im µM-Bereich. (Leibovitz 1963).
Dem Medium werden meist 2 - 10 % fötales Kälberserum (FBS), sowie Antibiotika (z. B. Penicillin, Ampicillin, Streptomycin) und Antimykotika (z. B. Nystatin, Amphotericin) zugesetzt. In den meisten Fällen findet sich auch der Zusatz von Glucose, fast immer in einer Konzentration von 30 mM.
In diesem Kulturmedium bleiben die elektrophysiologischen Eigenschaften der Neuronen isolierter Segmentalganglien über 3 Wochen unverändert, lediglich die Bindegewebskapsel trübt leicht ein (Miyazaki & Nicholls 1976, Ready & Nicholls 1979). Isolierte Neuronen können auch ohne Gliazellen für mehrere Wochen in-situ-Eigenschaften bewahren (Fuchs et al. 1981). Auch ohne den Zusatz von Glucose wird von einer Haltbarkeit der Zellen von bis zu 3 Wochen berichtet (Nicholls et al. 1990).
Unabhängig vom Leibovitz-Kulturmedium wurden basierend auf den vorhandenen Analysen verschiedene Blutersatzlösungen mit unterschiedlichen Anteilen organischer Säureresten vorgeschlagen. Falkenberg (2009) untersuchte den Einfluss von Blutersatzlösung nach Zerbst-Boroffka (5 mM Citrat, 15 mM Succinat, 10 mM Fumarat, 10 mM Laktat) auf das elektrophysiologische Verhalten der Retzius-Neuronen isolierter Segmentalganglien. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:
Das Ruhemembranpotential (Ruhe-Em) der Retzius-Neuronen war am Präparationstag unabhängig davon, ob sie in Normalsalzlösung (NSL) oder Blutersatzlösung (BEL) aufbewahrt wurden. Das Ruhe-Em brach in NSL innerhalb von drei Tagen praktisch zusammen, während es in BEL stabil blieb. In BEL werden über einen Zeitraum von mindestens 3 Tagen spontane Aktionspotentiale gebildet, in NSL lediglich einen Tag. Das Cl--Gleichgewichtspotential (ECl) der Retzius-Neuronen war in BEL dauerhaft negativer als in NSL. Die mechanische Stabilität und Transparenz der Bindegewebskapsel der Segmentalganglien blieb in BEL für mindestens 3 Tage erhalten, während in NSL aufbewahrte Ganglien schnell trüb und brüchig wurden.
Zokoll (2010) stellte fest, dass reduzierte BEL, die nur Citrat, Fumarat oder Succinat enthalten, ähnlich geeignet sind, die Haltbarkeit isolierter Ganglien zu verlängern, wie vollständige BEL mit allen Komponenten. Eine reduzierte BEL, die lediglich Laktat als organischen Säurerest enthielt, hatte hingegen keinen Effekt in diese Richtung. Als mögliche Erklärung für die verlängerte Haltbarkeit der Ganglien in Gegenwart organischer Säuren wurde die anaplerotische Zuführung von Citrat, Fumarat und Succinat in den Citratzyklus genannt.
1.5, Fragestellung:
Die Lage des Zentralnervensystems des Blutegels im Ventralgefäß legt die Vermutung nahe, dass die Energieversorgung des Nervensystems über das Blut des Tieres erfolgt. Die Untersuchungen von Falkenberg (2009) und Zokoll (2010), die sich auf eine Analyse der Blutzusammensetzung von Zerbst-Boroffka stützen, haben gezeigt, dass die Lebensdauer isolierter Segmentalganglien in Gegenwart von Citrat, Succinat oder Fumarat deutlich verlängert war, während Laktat diese Wirkung nicht hatte. Dieser B