Mutationsanalyse und Grundlagen für funktionale Untersuchungen zu den positionalen Kandidatengenen für katatone Schizophrenie, EIF2AK4 und SLC12A6, aus der chromosomalen Region 15q14-15

Diplomarbeit aus dem Jahr 2003 im Fachbereich Biologie - Humanbiologie, Note: 2,3, Bayerische Julius-Maximilians-Universität Würzburg (Biologie), Sprache: Deutsch, Abstract: Inhaltsangabe:Zusammenfassung:
In dieser Arbeit wurden einige molekularbiologische Ansätze zur Untersuchung des genetischen Einflusses auf periodische Katatonie, einem Subtyp der schizophrenen Erkrankungen, vorgestellt. Für EIF2AK4, eines der beiden hier behandelten Kandidatengene für Chromosom 15-bezogene Schizophrenie (SCZD10), wurde eine Mutationsanalyse durch Sequenzierung der Promotorregion sowie aller Exons dreier erkrankter Individuen und von zwei Kontrollpersonen durchgeführt. Dabei konnten keine Varianten nachgewiesen werden, welche sich auf das Patientensample beschränkten.
Ein im Vorfeld dokumentierter codierender SNP in Exon 28 schien aber in einer der untersuchten Familien mit der Krankheit zu kosegregieren. Daher wurde im Rahmen einer Assoziationsstudie durch RFLP Analyse einer großen Stichprobe geprüft, ob eine der beiden Varianten signifikant häufiger in Patienten als in gesunden Individuen auftritt.
Die Untersuchung ergab eine gleichmäßige Verteilung der Varianten in Patienten- und Kontroll-Sample in perfektem Hardy-Weinberg Equilibrium, so dass eine Assoziation mit der Erkrankung ausgeschlossen werden konnte. In der Promotorregion bzw. 5 UTR von SLC12A6, dem zweiten der untersuchten Kandidatengene, konnten in der Vergangenheit zwei kosegregierende A = G Varianten nachgewiesen werden, welche signifikant mit Schizophrenie und bipolaren Psychosen assoziiert sind. Es soll nun anhand eines Luciferase-Assays getestet werden, ob diese Varianten die Aktivität des Promotors verändern. In dieser Arbeit wurden die Vorbereitungen zur Durchführung des funktionalen Assays getroffen. Im Rahmen dieses Projektes wurde unter anderem das Exon1A von SLC12A6 aus drei verschiedenen Zelllinien auf Spleiß -sites überprüft.
Unsere Ergebnisse zeigten, dass in einer lymphoblastoiden Zelllinie sowie in SK-N-SH, einer neuroblastoiden Zelllinie, das Exon 1A nicht gespleißt wird. Dieses Ergebnis ist kohärent mit dem aktuellen Befund der UCSC April 2003 freeze release des Human Genome Projects.

Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis:
1.Abkürzungsverzeichnis6
2.Einleitung7
2.1Überblick: Die Krankheit Schizophrenie7
2.2Kausalitäten der Erkrankung8
2.3Wissenschaftliche Grundlagen für diese Arbeit9
2.4Die Kandidatengene GCN2 und KCC310
Abb.1: Chromosom 15q14-15 mit den Stammbäumen der Familien (F) 30, 09 und 1112
3.Fragestellung13
3.1Mutationsanalyse des Gens GCN2 durch automatisierte Sequenzierung13
3.2Assoziationsstudie einer Variante in Exon 28 von GCN2 durch RFLP Analyse13
3.3Vorbereitungen zur funktionalen Analyse seltener Varianten im Promotor von KCC314
3.4Überprüfung von KCC3 Exon 1A auf Spleißformen14
4.Material15
4.1Materialien allgemein15
4.1.1Klinisch15
Abb.2: Stammbäume für Familien 9 und 1115
4.1.2Puffer16
4.2Materialien zur Mutationsanalyse des Gens GCN2 durch automatisierte Sequenzierung17
4.2.1Polymerase chain reaction (PCR)17
Abb.3: Standard Peqgold 100 bp DNA-Leiter plus18
4.2.2Sequenzierreaktion19
4.2.3Fällung und Sequenzierung19
4.3Materialien zur Assoziationsstudie einer Variante in Exon 28 von GCN2 durch RFLP Analyse19
4.3.1PCR19
4.3.2Restriktion20
4.3.3Analyse der Restriktionsfragmente20
4.4Materialien für die Vorbereitungen zur funktionalen Analyse einer seltenen Variante im Promotor von KCC320
4.4.1PCR20
Abb.4: Peqgold 1kb DNA-Leiter (Peqlab, Erlangen)21
4.4.2Expressionstest21
4.4.3Restriktion und Ligation von Vektor und KCC3 Promotor22
4.4.4Elektroporation und Selektion der Klone23
4.4.5Nachweis A- und G-Varianten im Konstrukt24
4.4.6Vorbereitung des Sequenzier-...

Klappentext

Inhaltsangabe:Zusammenfassung: In dieser Arbeit wurden einige molekularbiologische Ansätze zur Untersuchung des genetischen Einflusses auf periodische Katatonie, einem Subtyp der schizophrenen Erkrankungen, vorgestellt. Für EIF2AK4, eines der beiden hier behandelten Kandidatengene für Chromosom 15-bezogene Schizophrenie (SCZD10), wurde eine Mutationsanalyse durch Sequenzierung der Promotorregion sowie aller Exons dreier erkrankter Individuen und von zwei Kontrollpersonen durchgeführt. Dabei konnten keine Varianten nachgewiesen werden, welche sich auf das Patientensample beschränkten. Ein im Vorfeld dokumentierter codierender SNP in Exon 28 schien aber in einer der untersuchten Familien mit der Krankheit zu kosegregieren. Daher wurde im Rahmen einer Assoziationsstudie durch RFLP Analyse einer großen Stichprobe geprüft, ob eine der beiden Varianten signifikant häufiger in Patienten als in gesunden Individuen auftritt. Die Untersuchung ergab eine gleichmäßige Verteilung der Varianten in Patienten- und Kontroll-Sample in perfektem Hardy-Weinberg Equilibrium, so dass eine Assoziation mit der Erkrankung ausgeschlossen werden konnte. In der Promotorregion bzw. 5 UTR von SLC12A6, dem zweiten der untersuchten Kandidatengene, konnten in der Vergangenheit zwei kosegregierende A => G Varianten nachgewiesen werden, welche signifikant mit Schizophrenie und bipolaren Psychosen assoziiert sind. Es soll nun anhand eines Luciferase-Assays getestet werden, ob diese Varianten die Aktivität des Promotors verändern. In dieser Arbeit wurden die Vorbereitungen zur Durchführung des funktionalen Assays getroffen. Im Rahmen dieses Projektes wurde unter anderem das Exon1A von SLC12A6 aus drei verschiedenen Zelllinien auf Spleiß -sites überprüft. Unsere Ergebnisse zeigten, dass in einer lymphoblastoiden Zelllinie sowie in SK-N-SH, einer neuroblastoiden Zelllinie, das Exon 1A nicht gespleißt wird. Dieses Ergebnis ist kohärent mit dem aktuellen Befund der ?UCSC April 2003 freeze release? des Human Genome Projects. Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis: 1.Abkürzungsverzeichnis6 2.Einleitung7 2.1Überblick: Die Krankheit Schizophrenie7 2.2Kausalitäten der Erkrankung8 2.3Wissenschaftliche Grundlagen für diese Arbeit9 2.4Die Kandidatengene GCN2 und KCC310 Abb.1: Chromosom 15q14-15 mit den Stammbäumen der Familien (F) 30, 09 und 1112 3.Fragestellung13 3.1Mutationsanalyse des Gens GCN2 durch automatisierte Sequenzierung13 3.2Assoziationsstudie einer Variante in Exon