Herstellung von Fluoreszenz-markierten Arrestin-Varianten zum Funktionsnachweis rekombinanter G-Protein-gekoppelter Rezeptoren

Diplomarbeit aus dem Jahr 2006 im Fachbereich Chemie - Biochemie, Note: 1,0, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg (Biochemie / Biotechnologie, Biotechnologie), Sprache: Deutsch, Abstract: Inhaltsangabe:Zusammenfassung:
In der vorliegenden Arbeit wurden Fluoreszenz-markierte Arrestin-Varianten hergestellt, die in einem geplanten, auf FRET basierenden Funktionstest für rekombinante renaturierte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (Glukagon like peptide-1-Rezeptor (GLP-1-Rezeptor) und Parathormon-Rezeptor (PTH-Rezeptor)) eingesetzt werden können.
Die in der Literatur beschriebene Expression und Reinigung des Arrestins konnte für die Mutante Arrestin2 (1-382) erfolgreich nachvollzogen werden. Durch eine aufeinander folgende Heparin- und Q-Sepharose-Chromatographie wurde das Protein mit der erwateten Reinheit und Ausbeute gewonnen.
Diese Mutante bindet mit hoher Affinität den aktivierten, aber unphosphorylierten Rezeptor. Hierdurch wird der geplante FRET-assay bedeutend vereinfacht, da weder ATP noch eine G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Kinase benötigt werden. Es wurden Reaktionsbedingungen gefunden, die zu einer äquimolaren Markierung des sieben Cystein-Reste enthaltenden Arrestin2 mit einem Fluoreszenzfarbstoff führten, wenngleich es nicht gelang, die Verteilung des Modifikationsgrades zu ermitteln.
Durch Auswahl eines geeigneten Stammes und Fermentation bei 10 °C wurden erstmals größere Mengen der Fusionsproteine Arr2-L-EGFP und Arr2-L-EYFP löslich in E.coli exprimiert.
Nach anfänglichen Schwierigkeiten bei der Verwendung des etablierten Protokolls und zwischenzeitlichen Reinigungsversuchen mit der hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC) gelang es, diese hydrophoben, zur Aggregation neigenden Proteine durch Abwandlung des etablierten Reinungsprotokolls zu isolieren.
Die sehr geringe Ausbeute führte zu der Überlegung, die Reinigung durch Anfügen eines His-tags an beide Fusionsproteine zu erleichtern. Nach der erfolgreichen Klonierung der beiden His-tag-Konstrukte wurden diese in Schüttelkulturen exprimiert und mittels IMAC gereinigt.
Die Ausbeute und die Reinheit beider Varianten blieben hinter den Erwartungen zurück. Versuche, diese Parameter durch den Zusatz verschiedener Additive zu verbessern, waren erfolglos. Die Bindungsaktivität des Arrestin2, des AEDANS-markierten Arrestin2 und der beiden Fusionsproteine mit und ohne His-tag wurde durch biomolekulare Interaktionsanalyse (BIACORE) nachgewiesen.
Eine eindeutige Bestätigung dieser Messungen durch die Isotherme Titrationskaloriemetrie ITC) gelang aufgrund von Substanzmangel und des hohen KD-Wertes der untersuchten Bindungsreaktion nicht.
Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis:
Inhaltsverzeichnis
1.Einleitung4
1.1Interzelluläre Kommunikation4
1.2G-Protein-gekoppelte Rezeptoren4
1.3GPCR-Signaltransduktion6
1.4Desensitisierung und Internalisierung von GPCR7
1.5Die Familie der Arrestine9
1.6Parathormon- , Glucagon-like-Peptide-1-Rezeptor und ihre Liganden11
1.7Fluoreszierende Proteine14
1.8Ziel dieser Arbeit15
2.Material und Methoden18
2.1Material18
2.1.1Chemikalien18
2.1.2Standards und Kit-Systeme19
2.1.3Enzyme und Antikörper19
2.1.4Chromatographiematerial, Säulen und sonstige Materialien19
2.1.5Oligodesoxynukleotide19
2.1.6Peptide20
2.1.7Organismen und Plasmide20
2.1.8Medien, Antibiotika und Puffer20
2.1.9Technische Geräte und Anlagen24
2.2Methoden25
2.2.1Molekularbiologische Methoden25
2.2.1.1Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)25
2.2.1.2Restriktionsverdau26
2.2.1.3Reinigung von DNA-Fragmenten27
2.2.1.4Ligation27
2.2.1.5Elektrotransformation von E. coli28
2.2.1.6Plasmidisolierung28
2.2.1.7Sequenzierung29
2.2.2Proteinexpression und Zellaufschluss29
2.2.2.1Bakterienkultivierung im Schüt...

Klappentext

Inhaltsangabe:Zusammenfassung: In der vorliegenden Arbeit wurden Fluoreszenz-markierte Arrestin-Varianten hergestellt, die in einem geplanten, auf FRET basierenden Funktionstest für rekombinante renaturierte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (Glukagon like peptide-1-Rezeptor (GLP-1-Rezeptor) und Parathormon-Rezeptor (PTH-Rezeptor)) eingesetzt werden können. Die in der Literatur beschriebene Expression und Reinigung des Arrestins konnte für die Mutante Arrestin2 (1-382) erfolgreich nachvollzogen werden. Durch eine aufeinander folgende Heparin- und Q-Sepharose-Chromatographie wurde das Protein mit der erwateten Reinheit und Ausbeute gewonnen. Diese Mutante bindet mit hoher Affinität den aktivierten, aber unphosphorylierten Rezeptor. Hierdurch wird der geplante FRET-assay bedeutend vereinfacht, da weder ATP noch eine G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Kinase benötigt werden. Es wurden Reaktionsbedingungen gefunden, die zu einer äquimolaren Markierung des sieben Cystein-Reste enthaltenden Arrestin2 mit einem Fluoreszenzfarbstoff führten, wenngleich es nicht gelang, die Verteilung des Modifikationsgrades zu ermitteln. Durch Auswahl eines geeigneten Stammes und Fermentation bei 10 °C wurden erstmals größere Mengen der Fusionsproteine Arr2-L-EGFP und Arr2-L-EYFP löslich in E.coli exprimiert. Nach anfänglichen Schwierigkeiten bei der Verwendung des etablierten Protokolls und zwischenzeitlichen Reinigungsversuchen mit der hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC) gelang es, diese hydrophoben, zur Aggregation neigenden Proteine durch Abwandlung des etablierten Reinungsprotokolls zu isolieren. Die sehr geringe Ausbeute führte zu der Überlegung, die Reinigung durch Anfügen eines His-tags an beide Fusionsproteine zu erleichtern. Nach der erfolgreichen Klonierung der beiden His-tag-Konstrukte wurden diese in Schüttelkulturen exprimiert und mittels IMAC gereinigt. Die Ausbeute und die Reinheit beider Varianten blieben hinter den Erwartungen zurück. Versuche, diese Parameter durch den Zusatz verschiedener Additive zu verbessern, waren erfolglos. Die Bindungsaktivität des Arrestin2, des AEDANS-markierten Arrestin2 und der beiden Fusionsproteine mit und ohne His-tag wurde durch biomolekulare Interaktionsanalyse (BIACORE) nachgewiesen. Eine eindeutige Bestätigung dieser Messungen durch die Isotherme Titrationskaloriemetrie ITC) gelang aufgrund von Substanzmangel und des hohen KD-Wertes der untersuchten Bindungsreaktion nicht.